Molecular Cause and Functional Impact of Altered Synaptic Lipid Signaling Due to a \u3cem\u3eprg-1\u3c/em\u3e Gene SNP

Loss of plasticity‐related gene 1 (PRG‐1), which regulates synaptic phospholipid signaling, leads to hyperexcitability via increased glutamate release altering excitation/inhibition (E/I) balance in cortical networks. A recently reported SNP in prg‐1 (R345T/mutPRG‐1) affects ~5 million European and US citizens in a monoallelic variant. Our studies show that this mutation leads to a loss‐of‐PRG‐1 function at the synapse due to its inability to control lysophosphatidic acid (LPA) levels via a cellular uptake mechanism which appears to depend on proper glycosylation altered by this SNP. PRG‐1+/− mice, which are animal correlates of human PRG‐1+/mut carriers, showed an altered cortical network function and stress‐related behavioral changes indicating altered resilience against psychiatric disorders. These could be reversed by modulation of phospholipid signaling via pharmacological inhibition of the LPA‐synthesizing molecule autotaxin. In line, EEG recordings in a human population‐based cohort revealed an E/I balance shift in monoallelic mutPRG‐1 carriers and an impaired sensory gating, which is regarded as an endophenotype of stress‐related mental disorders. Intervention into bioactive lipid signaling is thus a promising strategy to interfere with glutamate‐dependent symptoms in psychiatric diseases

Purification and characterisation of the respiratory supercomplex III/IV from Corynebacterium glutamicum and phospholipid analysis of membrane proteins

The respiratory chain is composed of protein complexes residing in the inner mitochondrial membrane of eukaryotes or in the cytoplasmic membrane of prokaryotes. This cellular energy converter transforms a redox potential stored in low potential substrates into an electrochemical potential across the respective membrane. Typical respiratory chains contain the complexes I, II, III and IV named according to their sequence in the respiratory chain reaction. Electrons of low potential substrates enter at complex I or II and are passed via complex III to complex IV where they are transferred to oxygen. The transport of electrons between the complexes is mediated by small electron shuttles like quinol or cytochrome c. Two different models describe their exchange either by (1) random collision of freely diffusible electron shuttles and membrane protein complexes or (2) arrangement of the complexes in supercomplexes enabling direct channeling of electron shuttles. In the Gram positive bacterium Corynebacterium glutamicum, the complex III to complex IV electron shuttle cytochrome c is not diffusible but a covalently bound part of the diheme cytochrome subunit QcrC of complex III. Therefore, the complexes III and IV have to form a supercomplex for electron transduction. The aim of this thesis was to purify and characterise this obligatory supercomplex III/IV of C. glutamicum. To gain sufficient biomass of C. glutamicum as starting material for purification, a phosphate buffered minimal medium was developed that enabled yield of total 120 g wet cell mass (38 g dry mass) in 12 L (6×2 L) shaking cultures. The determined conversion factor of glucose into biomass was 0.46 g/g indicating an intact respiratory chain. The yield was increased by bioreactor cultivation to ~690 g wet cell mass (~220 g dry mass) in ~10 L culture volume. A previously described homologous expression system was applied that produces the complex IV subunit CtaD with a fused Strep-tag II to facilitate purification. Affinity purifications using the Strep-tag II affinity to Strep-Tactin resin yielded a mixture of complexes and supercomplexes. Two supercomplex III/IV versions named supercomplex A and B and free complex IV were identified in this mixture by size exclusion chromatography, redox difference spectroscopy and two dimensional polyacrylamide gel electrophoresis including blue native polyacrylamide electrophoresis. The here presented downscaled blue native polyacrylamide electrophoresis method with analysis times of ~1 h enabled efficient screening of factors influencing the stability of supercomplex III/IV. The screening resulted that the integrity of supercomplex III/IV is preserved by using neutral detergents at minimal detergent to protein ratios for solubilisation and low detergent concentrations for purification and storage slightly above the required critical micellar concentration. Furthermore, pH <=7.5 is required for stability of supercomplex III/IV. Large biomass yields enabled upscaling of supercomplex III/IV affinity purification. Application of the identified stability conditions resulted in affinity purified samples free of supercomplex B. The major component supercomplex A was efficiently separated from residual free complex IV by preparative size exclusion chromatography. Concentration of purified supercomplex A by ultracentrifugation resulted in integrity of the supercomplex for several days at 4 °C. Purified supercomplex A contains ten different previously described subunits. The heme content of supercomplex A relative to the protein mass is heme A: 6.0 &#956;mol/g, heme B: 6.5 &#956;mol/g, and heme C: 5.8 &#956;mol/g determined by redox difference spectroscopy and biochemical protein quantification. This indicates an equimolar ratio of complex III and complex IV in supercomplex A. Supercomplex A has quinol oxidase activity that is inhibited by stigmatellin or sodium azide. The turnover number of transferred electrons per complex III monomer is 148 s&#8722;1 at 25° C. The homogeneity and stability of the prepared supercomplex A enabled the growth of threedimensional crystals of up to 0.1 mm in length. Their composition of supercomplex A was verified by redox difference spectroscopy of intact crystals and blue native polyacrylamide electrophoresis of dissolved crystals. The crystals diffracted X-rays corresponding to a resolution of ~10 Å. Electron microscopy of negative stained samples revealed the uniform shape of purified supercomplex A particles with dimensions of 22 × 9 nm in the view plane. Combined heme quantification, size determination, determined activity, symmetry considerations, and particle shape indicate that supercomplex A has a central dimer of complex III and two monomers of complex IV on opposite sides. This conformation is functionally reasonable because it provides each complex III monomer with one complex IV monomer as electron acceptor. Therefore, the stoichiometry of supercomplex A is most likely III2IV2. The sensitivity of supercomplex A to detergents indicated a role of phospholipids in its stability. Therefore, a method for phospholipid identification and quantification was developed that is suitable for detergent solubilised crude and purified membrane protein samples. The analysis combines separation of phospholipid classes according to their head group by normal phase high performance liquid chromatography with evaporative light scattering detection. Calibration with external standard allows quantification of phospholipid amount in the range of 0.25-12 &#956;g. The method is verified by analysing the phospholipid content of the well characterised complex III of Saccharomyces cerevisiae. The reduction of its phospholipid content during its purification steps is monitored. The complex III sample purified to crystallisation quality contains the phospholipid content that was also observed in previously reported structures determined by X-ray crystallography. Purified stable supercomplex A from C. glutamicum revealed a large content of bound phospholipids. The main differences between intact supercomplex A and a mixture of potentially disintegrated smaller complexes is that intact supercomplex A has a doubled phosphatidic acid content and an increased phosphatidyl glycerol content. The importance of the small anionic phosphatidic acid for mediation of contacts between complexes in a supercomplex is discussed. The total phospholipid content of stable supercomplex A is sufficient for a complete belt surrounding the supercomplex in the membrane plane. This indicates that also all essential internal phospholipid binding positions are occupied and potentially stabilise supercomplex A.Organismen wandeln mit Hilfe der Atmungskette das Redoxpotential von Substraten in ein elektrochemisches Membranpotential um. Die Atmungskette befindet sich in der inneren mitochondrialen Membran von Eukaryoten oder in der zytoplasmatischen Membran von Prokaryoten. Die beteiligten Membranproteinkomplexe sind entsprechend ihrer Reihenfolge in der Atmungskettenreaktion als Komplex I, II, III und IV benannt. Elektronen von Substraten mit niedrigem Redoxpotential treten bei Komplex I oder II in die Atmungskette ein, und werden über Komplex III an Komplex IV weitergegeben, wo sie auf Sauerstoff übertragen werden. Zwischen den Komplexen werden die Elektronen mittels kleiner Überträgermoleküle wie Quinol oder Cytochrom c weitergegeben, indem diese die Elektronen vom vorangehenden Komplex aufnehmen, und beim folgenden Komplex abgeben. Zwei verschiedene Modelle beschreiben den Austausch dieser Elektronenüberträger zwischen den Komplexen durch (1) zufällige Kollision von frei diffundierenden Elektronenüberträgern und Komplexen oder (2) Anordnung der Komplexe zu Superkomplexen, die direkten Austausch der Elektronenüberträger ermöglichen. Im Gram positiven Bakterium Corynebacterium glutamicum ist das Cytochrom c, welches verantwortlichist für den Elektronentransport von Komplex III zu Komplex IV, ein kovalent gebundener integraler Teil der Dihäm-Cytochrom-Untereinheit QcrC von Komplex III. Daher muss C. glutamicum einen Superkomplexes III/IV bilden, um die Elektronen weiterzugeben. Das Ziel dieser Arbeit ist die Reinigung und Charakterisierung dieses obligaten Superkomplexes III/IV. Zur Gewinnung ausreichender Biomasse von C. glutamicum als Ausgangsmaterial für die Reinigung, wurde ein phosphat-gepuffertes Minimalmedium entwickelt, das Ausbeuten von 120 g Zell- Feuchtmasse (38 g Zell-Trockenmasse) in 12 L (6×2 L) Schüttelkultur ermöglicht. Pro Gramm Glukose wuchsen C. glutamicum Zellen mit einer Trockenmasse von 0,46 g. Dieser hohe Umwandlungkoeffizient deutet auf Veratmung des Substrates mittels einer intakten Atmungskette. Eine weitere Steigerung der Ausbeute an Biomasse wurde durch Kultivierung im Bioreaktor erreicht. Nach 13,5 h Kultivierung im Bioreaktor betrug die Konzentration der Zell-Feuchtmasse 69 g/L (Zell-Trockenmasse 22 g/L) im Kulturmedium. Das Kulturvolumen von circa 10 L erbrachte eine Ausbeute von circa 690 g Zell-Feuchtmasse (circa 220 g Zell-Trockenmasse), die als Ausgangsmaterial für die Reinigung des Superkomplexes III/IV dienten. Ein in Vorfeld beschriebenes homologes Expressionssystem, das die Komplex IV Untereinheit CtaD mit einem fusionierten Strep-Tactin-Affinitätspeptid (Strep-tag II) produziert, wurde eingesetzt um die Reinigung des Superkomplexes III/IV zu unterstützen. Erste Affinitäts-Reinigungen ergaben eine Mischung aus Komplexen und Superkomplexen. Freier Komplex IV und zwei verschiedene Superkomplex III/IV-Versionen, Superkomplex A und B benannt, wurden in dieser Mischung identifiziert durch Größenausschluss-Chromatographie, Redox-Differenz-Spektroskopie und zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese einschließlich Blau-Nativer-Polyacrylamid- Gelelektrophorese. Die hier vorgestellte verkleinerte Variante der Blau-Nativen-Polyacrylamid- Gelelektrophorese mit Analysedauer von etwa 1 h ermöglichte eine effiziente Untersuchung, welche Faktoren die Stabilität des Superkomplexes III/IV beeinflussen. Die Untersuchung ergab, dass der größte Superkomplexes III/IV von C. glutamicum (Superkomplex A) mit neutralen Detergenzien bei minimalen Detergens zu Protein Verhältnissen solubilisiert werden kann; geeignet ist z.B. b-D-dodecylmaltosid in einem Massenverhältnis von 1:1 zum Protein. Der im Solubilisat bzw. affinitäsgereinigten Protein vorhandene Anteil des kleineren Superkomplex B und des freien Komplex IV wird durch höhere Detergenzanteile vergrößert. Nach Solubilisierung und Affinitätsreiningung mit ionischen Detergenzien konnte kein Superkomplex III/IV nachgewiesen werden, was auf die Zerstörung der schwachen Bindungen zwischen den Komplexen zurückgeführt wird. Weiterhin ist der Superkomplex A auch in neutralen Detergenzien nur bei pH Werten <=7,5 stabil. Weder das Einfrieren der C. glutamicum Membranen, noch die Ionenstärke bei der Solubilisierung und Reinigung zeigten erkennbaren Einfluss auf die Integrität des Superkomplexes A. Die großen Ausbeuten an C. glutamicum Biomasse bei der Kultivierung ermöglichten eine Vergrößerung der Affinitätsreinigung von Superkomplex III/IV. Berücksichtigung der identifizierten Stabilitätsbedingungen ergab affinitätsgereinigte Proben, die frei von Superkomplex B waren, oder nur einen sehr geringem Anteil daran aufwiesen. Der Hauptbestandteil Superkomplex A konnte mittels präparativer Größenausschluss-Chromatographie effizient vom restlichen freien Komplex IV getrennt werden. Für die Stabilität des gereinigten Superkomplexes A erwies es sich weiterhin als entscheidend, dass das Massenverhältnis von Detergens zu Protein bei und nach der Reinigung minimiert wurde. Daher wurde der gereinigte Superkomplex A mittels Ultrazentrifugation konzentriert, wobei ungebundenes Detergens kaum angereichert wird. Der so konzentrierte Superkomplex A ist bei 4°C für mehrere Tage stabil. Der gereinigte Superkomplex A enthält zehn verschiedene Untereinheiten. Die Identitäten derUntereinheiten und ihre Sequenzen sind aus vorangehenden Untersuchungen bekannt. Drei funktionelle Untereinheiten (QcrA, QcrB, QcrC) werden Komplex III zugeordnet, und vier Untereinheiten (CtaC, CtaD, CtaE, CtaF) werden Komplex IV zugeordnet. Die drei übrigen im gereinigten Superkomplex III/IV enthaltenen Untereinheiten (P20, P24, P29) haben unbekannte Funktionen und Zuordnungen und wurden entsprechend ihrer scheinbaren Molekülmassen in der denaturierenden Polyacrylamid-Gelelektrophorese benannt. Der Hämgehalt von Superkomplex A relativ zur Proteinkonzentration wurde mittels Redox-Differenz-Spektroskopie ermittelt und beträgt für Häm A 6,0 &#956;mol/g, für H äm B 6,5 &#956;mol/g und für Häm C 5,8 &#956;mol/g. Dies deutet auf ein äquimolares Verhältnis von Komplex III und Komplex IV im Superkomplex A hin, da in C. glutamicum ein Komplex III-Monomer je zwei Häm B und Häm C enthält und ein Komplex IV-Monomer zwei Häm A enthält. Der gereinigte stabile Superkomplex A hat Quinol-Oxidase-Aktivität. Die Wechselzahl bezogen auf transferrierte Elektronen pro Komplex III-Monomer ist 148 s&#8722;1 bei 25°C. Die Quinol-Oxidase-Aktivität wird durch den Komplex III-Inhibitor Stigmatellin oder den Komplex IV-Inhibitor Natriumazid inhibiert. Die Homogenität und Stabilität der Superkomplex A Präparationen ermöglichten das Wachstum von dreidimensionalen Kristallen mit Längen von bis zu 0.1 mm in Dampfdiffusionsansätzen in Gegenwart von Polyethylenglycol. Dass die Kristalle aus Superkomplex A bestehen, wurde mittels Redox-Differenz-Spektroskopie an intakten Kristallen und Blau-Nativer-Polyacrylamid- Gelelektrophorese an aufgelösten Kristallen gezeigt. Die Kristalle beugten Röntgenstrahlung entsprechend einer Auflösung von ungefähr 10 Å. Elektronenmikroskopie von negativ gefärbten Proben enthüllte die einheitliche Form der Superkomplex A Partikel mit einer Größe von 22 × 9 nm in der Sichtebene. Kombination von Häm-Quantifizierung, Größenbestimmung, Aktivitätsmessung, Symmetriebedingungen, und Partikelformdeuten darauf hin, dass Superkomplex A aus einem zentralen Komplex III-Dimer besteht, und an zwei gegenüber liegenden Seiten jeweils ein Komplex IV-Monomer gebunden ist. Diese Konformation ist funktionell sinnvoll, weil dadurch jedes Komplex III Monomer mit einem Komplex IV Monomer als Elektronenakzeptor interagiert. Die wahrscheinliche Stöchiometrie des Superkomplexes A ist daher III2IV2. Die Empfindlichkeit des Superkomplexes A gegenüber Detergenzien deutete auf die Wichtigkeit von Phospholipiden für seine Stabilität hin. Deshalb wurde eine Methode zur Identifizierung und Quantifizierung von Phospholipiden entwickelt, die sowohl für Membranproben, als auch für detergens-solubilisierte und gereinigte Membranproteine geeignet ist. Die Methode kombiniert Trennung der Phospholipide nach ihren Kopfgruppen mittels Normal-Phasen-Hochleistungs- Flüssigchromatographie mit Detektion mittels eines Verdampfungs-Lichtstreuungs-Detektors. Bei der Normal-Phasen-Hochleistungs- Flüssigchromatographie binden die polaren Kopfgruppen der Phospholipide mittels polarer Interaktionen an das polare Säulenmaterial, welches hier aus Silikagel besteht. Das zu Beginn der Chromatographie unpolare Laufmittel enthält Chloroform, Methanol, Wasser und Ammoniak und wird durch eine graduelle Erhöhung der Anteile an Methanol und Wasser stetig polarer. Die Phospholipide werden in der Reihenfolge der steigenden Polaritäten der Kopfgruppen eluiert. Die hydrophoben Reste haben einen geringeren Einfluss auf das Elutionsverhalten. Zur kontinuierlichen Detektion der eluierenden Phospholipide wird das Eluat nach der Säule in den Verdampfungs-Lichtstreuungs-Detektors geleitet. Hier wird das Eluat vernebelt. Durch leichte Erwärmung verdampfen bzw. verdunsten die flüchtigen Laufmittelbestandteile, nicht-flüchtige Bestandteile wie Phospholipide verursachen die Streuung eines Lichtstrahls, die gemessen wird. Das Chromatographie-System wurde für die Phospholipide Cardiolipin, Phosphatidyl-Ethanolamin, -Inositol, -Säure und -Cholin und die Gegenwart von Alkyl-Maltosid Detergens optimiert. Das entwickelte System ermöglicht deren gleichzeitige Trennug und Detektion mit vergleichbarer Sensitivität. Kalibrierung mit externen Standards erlaubt die Quantifizierung von Phospholipid-Massen im Bereich von 0,25-12 &#956;g. Die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Analyse wird beschrieben durch Standardabweichungen der erhaltenen integrierten Signalflächen von unter 10% bei wiederholter Injektion von Phospholipidmassen ab 1 &#956;g. Die Methode der Phospholipid-Analyse wurde verifiziert durch Quantifizierung des Phospholipid Gehaltes des gut charakterisierten Komplex III von Saccharomyces cerevisiae. Bei der mehrstufigen chromatographischen Reinigung des Komplexes wurde die Abnahme des Gehaltes bestimmter Phospholipide beobachtet. Der Gehalt an Phosphatidyl-Cholin und Phosphatidyl-Inositol sinkt auf jeweils ein Viertel, der Gehalt an Phosphatidyl-Ethanolamin und Phosphatidyl-Inositol sinkt auf jeweils die Hälfte, wärend der Gehalt an Cardiolipin weitgehend konstant bleibt. Die essentielle Bedeutung des Cardiolipins für die funktionelle Integrität des Komplexes wird diskutiert. Die Komplex III-Probe von S. cerevisiae, die bis zur Kristallisationsqualität gereinigt wurde, zeigte den Phospholipidgehalt, der auch in Strukturen von vorhergehenden Röntgenstrukturanalysen gefunden wurde. Im Mittel wurden die folgenden Phospholipid Moleküle pro Komplex III-Monomer gemessen (in Klammern sind die Werte der Röntgenstrukturanalysen angegeben): Cardiolipin 2,5 (2,5) / Phosphatidyl-Ethanolamin 1,5 (2) / Phosphatidyl-Inositol 0,9 (1) / Phosphatidyl-Säure 0,6 (0) / Phosphatidyl-Cholin 1,9 (2). Die Molekülmassen der Phospholipide von Komplex III von S. cerevisiae wurden mittels Matrix unterstützter Laser-Desorption/Ionisierung gemessen, um die gesamten Längen und Sättigungen der Fettsäurereste zu bestimmen. Komplex III enthielt Cardiolipin mit gesamten Fettsäurelängen von 60 bis 72 Kohlenstoffen und insgesamt drei bis vier ungesättigte Bindungen. Dass das Membransolubilisat und der gereinigte Komplex Cardiolipin mit den gleichen Fettsäureresten enthält, deutet darauf hin, dass die Bindung von Cardiolipin nicht fettsäurespezifisch ist. Eine vergleichbare nicht fettsäurespezifische Bindung wurde für Phosphatidyl-Inositol bestimmt, das gesamte Fettsäurelängen von 26 bis 36 Kohlenstoffen mit maximal einer ungesättigte Bindungen aufwies. Im Gegensatz dazu unterschied sich die Zusammensetzung der Fettsäurereste von Phosphatidyl-Cholin deutlich im Membransolubilisat und im gereinigten Komplex III. Das Solubilisat enthielt gesamte Fettsäurelängen von 24 bis 40 Kohlenstoffen mit bis zu zwei ungesättigte Bindungen. Am gereinigten Komplex III blieben vorwiegend Phosphatidyl-Choline mit gesamten Fettsäurelängen von 32 bis 36 Kohlenstoffen gebunden, was auf eine fettsäurespezifische Bindung hinweist. Die Untersuchung des Komplex III von S. cerevisiae zeigte die Anwendbarkeit und Genauigkeit der hier vorgestellten chromatographischen Phospholipid Quantifizierungsmethode für Membranproteinproben. Die gleichartige Analyse der Membranen von C glutamicum zeigte, dass Phosphatidyl- Glycerol mit 65% Massenanteil das dominierende Phospholipid ist. Der Cardiolipin Massenanteil an den Phospholipiden beträgt 13% und Phosphatidyl-Säure macht nur einen Massenanteil von 4% aus. Der Rest entfält auf unidentifizierte vermutliche Phospholipide, die nahe bei Phosphatidyl-Glycerol oder im Bereich von Phospholipiden mit zuckerhaltigen Kopfgruppen eluieren. Auch nach Affinitäts- und Größenausschluss-Chromatographie zur Reinigung des Superkomplexes III/IV bildet Phosphatidyl-Glycerol den Hauptbestandteil der gebundenen Phospholipide. Der gereinigte stabile Superkomplex A von C. glutamicum zeigte einen sehr hohen Phospholipidgehalt. Bezogen auf den Hämgehalt enthält der wahrscheinliche Superkomplex III2IV2 im Durchschnitt 102 Moleküle Phosphatidyl-Glycerol, 6,4 Moleküle Cardiolipin und 12,7 Moleküle Phosphatidyl-Säure sowie kleinere Mengen der unidentifizierten vermutlichen Phospholipide. Der Hauptunterschied zwischen intaktem Superkomplex A und einer Mischung von wahrscheinlich zerfallenen kleineren Komplexen ist, dass im Superkomplex A der Gehalt an Phosphatidyl-Säure doppelt so hoch ist, und auch der Gehalt an Phosphatidyl-Glycerol etwas erhöht ist. Die Bedeutung der Phospholipide und insbesondere der Phosphatidyl-Säure für die Vermittlung von Kontakten zwischen den Komplexen wird diskutiert. Der gemessene gesamte Gehalt von 138 Phospholipiden pro stabilem Superkomplex A ist ausreichend für einen vollständigen Gürtel um den Superkomplex in beiden Ebenen der Lipiddoppelschicht der nativen Membran. Das deutet darauf hin, dass in dem gereinigten stabilen Superkomplex A alle essentiellen und möglichen Phospholipid-Bindungstellen besetzt sind, und zur Stabilisierung beitragen können

Role of phospholipids in respiratory cytochrome bc1 complex catalysis and supercomplex formation

Specific protein–lipid interactions have been identified in X-ray structures of membrane proteins. The role of specifically bound lipid molecules in protein function remains elusive. In the current study, we investigated how phospholipids influence catalytic, spectral and electrochemical properties of the yeast respiratory cytochrome bc1 complex and how disruption of a specific cardiolipin binding site in cytochrome c1 alters respiratory supercomplex formation in mitochondrial membranes. Purified yeast cytochrome bc1 complex was treated with phospholipase A2. The lipid-depleted enzyme was stable but nearly catalytically inactive. The absorption maxima of the reduced b-hemes were blue-shifted. The midpoint potentials of the b-hemes of the delipidated complex were shifted from −52 to −82 mV (heme bL) and from +113 to −2 mV (heme bH). These alterations could be reversed by reconstitution of the delipidated enzyme with a mixture of asolectin and cardiolipin, whereas addition of the single components could not reverse the alterations. We further analyzed the role of a specific cardiolipin binding site (CLi) in supercomplex formation by sitedirected mutagenesis and BN-PAGE. The results suggested that cardiolipin stabilizes respiratory supercomplex formation by neutralizing the charges of lysine residues in the vicinity of the presumed interaction domain between cytochrome bc1 complex and cytochrome c oxidase. Overall, the study supports the idea, that enzyme-bound phospholipids can play an important role in the regulation of protein function and protein–protein interaction

The obligate respiratory supercomplex from Actinobacteria

International audienceActinobacteria are closely linked to human life as industrial producers of bioactive molecules and as human pathogens. Respiratory cytochrome bcc complex and cytochrome aa3 oxidase are key components of their aerobic energy metabolism. They form a supercomplex in the actinobacterial species Corynebacterium glutamicum. With comprehensive bioinformatics and phylogenetic analysis we show that genes for cyt bcc-aa3 supercomplex are characteristic for Actinobacteria (Actinobacteria and Acidimicrobiia, except the anaerobic orders Actinomycetales and Bifidobacteriales). An obligatory supercomplex is likely, due to the lack of genes encoding alternative electron transfer partners such as mono-heme cyt c. Instead, subunit QcrC of bcc complex, here classified as short di-heme cyt c, will provide the exclusive electron transfer link between the complexes as in C. glutamicum. Purified to high homogeneity, the C. glutamicum bcc-aa3 supercomplex contained all subunits and cofactors as analyzed by SDS-PAGE, BN-PAGE, absorption and EPR spectroscopy. Highly uniform supercomplex particles in electron microscopy analysis support a distinct structural composition. The supercomplex possesses a dimeric stoichiometry with a ratio of a-type, b-type and c-type hemes close to 1:1:1. Redox titrations revealed a low potential bcc complex (EmISP = + 160 mV, EmbL = − 291 mV, EmbH = − 163 mV, Emcc = + 100 mV) fined-tuned for oxidation of menaquinol and a mixed potential aa3 oxidase (EmCuA = + 150 mV, Ema/a3 = + 143/+317 mV) mediating between low and high redox potential to accomplish dioxygen reduction. The generated molecular model supports a stable assembled supercomplex with defined architecture which permits energetically efficient coupling of menaquinol oxidation and dioxygen reduction in one supramolecular entity

Cross-recognition of a myelin peptide by CD8+ T cells in the CNS is not sufficient to promote neuronal damage

Multiple sclerosis (MS) is an inflammatory disease of the CNS thought to be driven by CNS-specific T lymphocytes. Although CD8 T cells are frequently found in multiple sclerosis lesions, their distinct role remains controversial because direct signs of cytotoxicity have not been confirmed in vivo. In the present work, we determined that murine ovalbumin-transgenic (OT-1) CD8 T cells recognize the myelin peptide myelin oligodendrocyte glycoprotein 40–54 (MOG) both in vitro and in vivo. The aim of this study was to investigate whether such cross-recognizing CD8 T cells are capable of inducing CNS damage in vivo. Using intravital two-photon microscopy in the mouse model of multiple sclerosis, we detected antigen recognition motility of the OT-1 CD8 T cells within the CNS leading to a selective enrichment in inflammatory lesions. However, this cross-reactivity of OT-1 CD8 T cells with MOG peptide in the CNS did not result in clinically or subclinically significant damage, which is different from myelin-specific CD4 Th17-mediated autoimmune pathology. Therefore, intravital imaging demonstrates that local myelin recognition by autoreactive CD8 T cells in inflammatory CNS lesions alone is not sufficient to induce disability or increase axonal injury

PRG-1 regulates synaptic plasticity via intracellular PP2A/β1-integrin signaling

Alterations in dendritic spine numbers are linked to deficits in learning and memory. While we previously revealed that postsynaptic plasticity-related gene 1 (PRG-1) controls lysophosphatidic acid (LPA) signaling at glutamatergic synapses via presynaptic LPA receptors, we now show that PRG-1 also affects spine density and synaptic plasticity in a cell-autonomous fashion via protein phosphatase 2A (PP2A)/β1-integrin activation. PRG-1 deficiency reduces spine numbers and β1-integrin activation, alters long-term potentiation (LTP), and impairs spatial memory. The intracellular PRG-1 C terminus interacts in an LPA-dependent fashion with PP2A, thus modulating its phosphatase activity at the postsynaptic density. This results in recruitment of adhesome components src, paxillin, and talin to lipid rafts and ultimately in activation of β1-integrins. Consistent with these findings, activation of PP2A with FTY720 rescues defects in spine density and LTP of PRG-1-deficient animals. These results disclose a mechanism by which bioactive lipid signaling via PRG-1 could affect synaptic plasticity and memory formation

Molecular cause and functional impact of altered synaptic lipid signaling due to a prg‐1 gene SNP

Loss of plasticity-related gene 1 (PRG-1), which regulates synaptic phospholipid signaling, leads to hyperexcitability via increased glutamate release altering excitation/inhibition (E/I) balance in cortical networks. A recently reported SNP in prg-1 (R345T/mutPRG-1) affects ~5 million European and US citizens in a monoallelic variant. Our studies show that this mutation leads to a loss-of-PRG-1 function at the synapse due to its inability to control lysophosphatidic acid (LPA) levels via a cellular uptake mechanism which appears to depend on proper glycosylation altered by this SNP. PRG-1(+/-) mice, which are animal correlates of human PRG-1(+/mut) carriers, showed an altered cortical network function and stress-related behavioral changes indicating altered resilience against psychiatric disorders. These could be reversed by modulation of phospholipid signaling via pharmacological inhibition of the LPA-synthesizing molecule autotaxin. In line, EEG recordings in a human population-based cohort revealed an E/I balance shift in monoallelic mutPRG-1 carriers and an impaired sensory gating, which is regarded as an endophenotype of stress-related mental disorders. Intervention into bioactive lipid signaling is thus a promising strategy to interfere with glutamate-dependent symptoms in psychiatric diseases